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植物养分利用与重金属毒害原位研究先进技术综述

植物养分利用与重金属毒害原位研究先进技术综述

  植物生长离不开各种的金属与非金属元素。这些元素通过土壤、大气、水进入植物体内,通过植物体内的运输和一系列生理生化反应分布到植物的各个部位。各种元素对植物的影响一直是植物研究的重要热点之一。这项研究的焦点主要集中在两个方面:1. 由于日趋严重的粮食安全问题,如何获得最优化的施肥方法既可以提高作物产量和质量,又能减少对环境造成的可能伤害(富营养化等)是摆在全人类面前的重大课题;2. 现代工业造成环境中严重的重金属污染,这些重金属通过植物富集并传导到动物圈和人类。为了搞清楚这两个问题的运行规律并找到解决方案,就必须对植物在不同元素条件的生理生态反应进行研究。

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图1. 矿物质和水分在植物体内的运输过程(https://online.science.psu.edu/)

很多传统的植物生理生化指标和元素分析方法大都需要将样品取回实验室,并进行破坏性预处理。这一过程中很多重要的信息都可能缺失或者产生变化,而且不能做到对同一个样品进行长期监测,难以估量植物不同生长期的差异变化。本文将介绍一些国际上最先进的用于植物原位养分利用与重金属毒害研究的无损/准无损仪器技术。

一、   叶绿素荧光/叶绿素荧光成像分析技术

image.png叶绿素荧光动态分析技术是目前最快捷无损的监测植物生物与非生物胁迫下光合性能的技术,也是用于植物生理学和生态生理学研究的最有效的、最权威的和应用最广的技术之一(Lu,2001;Lu,1999)。因此在叶绿素荧光技术刚刚发展成熟之初,这项技术就被用于植物养分和金属胁迫研究。1985年Sivak发现N、P、K、Mn、Fe、S或Cu缺乏的甜菜,叶绿素荧光曲线与对照组产生了偏离(Sivak, 1985)。Abadia在1988年就提出了用叶绿素荧光测量的方法来快速简便地检测植物营养缺失(Abadia,1988)。

但是传统的叶绿素荧光技术也有其局限性。一般的叶绿素荧光仪仅能通过光纤测量一个点的总值。无法展示样品不同部位、结构的差异,更难以研究胁迫受损组织的分布以及受损部分和健康部分的差异,测量的数据无法代表测量样品的全部情况。随着Charge-Coupled Device(CCD)相机技术、电脑图像分析技术以及LED光源板技术的成熟,从上世纪八十年代末开始,叶绿素荧光成像技术开始逐渐发展起来。Ladislav Nedbal等于上世纪90年代末期发明了与PAM技术相结合的叶绿素荧光成像技术,研制成功了第一台FluorCam调制式叶绿素荧光成像仪Nedbal,2000),使得叶绿素荧光研究正式进入二维时代。这一技术发明以后,就因为其可以直观定量反映营养元素与重金属对植物光合系统产生影响的部位、分布、面积及具体机理,而迅速取代传统的叶绿素荧光仪。

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图3. 最初的FluorCam调制式叶绿素荧光成像仪设计图与荧光成像图(Nedbal,2000)

image.png山东农业大学使用FluorCam研究了两种玉米在不同施氮条件下光合特性的变化(Li, 2012)。研究发现,施加氮肥使两个品种的最大光化学效率Fv/Fm和量子产额ΦPSII都有所升高,而ΦPSII的升高幅度要高于Fv/Fm,表明氮肥对PSII的实际功能活性更有作用。同时玉米品种HZ4荧光参数的升高幅度也要高于Q319,这应该是由于HZ4是一种低N效率的非持绿玉米。

Vaculík研究了硅元素对缓解玉米镉毒害的作用。通过检测玉米叶片的实际量子产额ΦPSII发现:在低浓度镉处理下,添加硅元素几乎可以消除镉的毒害;在高浓度处理下,添加硅元素不但减轻了镉毒害的程度,同时也使毒害面积大为减少(Vaculík,2015)。

FluorCam叶绿素荧光成像系统也用于大气重金属等污染监测研究。Hida通过对监测钢铁厂不同距离白杨叶片的相对荧光衰减指数Rfd,发现了空气污染影响植物光合系统的规律与季节波动,也为监测空气污染找到了灵敏直观的生物指标(Hida, 2014)。

图7. FluorCam系列叶绿素荧光成像系统

二、    多光谱荧光动态显微成像技术(Fluorescence Kinetic Microscope)

FluorCam叶绿素荧光成像技术的出现解决了研究各种胁迫因素对植物宏观光合表型的问题。但对于微观层次,每个细胞乃至叶绿体的光合表型研究还是无能为力。就在Nedbal开发FluorCam叶绿素荧光成像技术的同时,他就与德国康斯坦丁大学教授Küpper、捷克科学院Martin Trtilek(Photon Systems Instruments公司总裁,NedbalPhoton Systems Instruments公司首席科学家)共同开发了而用于微观荧光成像的Fluorescence kinetic microscopy(FKM)荧光动力学显微成像技术(Küpper,2000)。从此叶绿素荧光动力学研究才能够研究各种不同尺度的样品,比如叶绿体、细胞、植物组织、器官乃至整个植物个体。之后,FKM技术被广泛用于藻类的叶绿素荧光研究。

2007 年,Küpper 继续与 Martin Trtilek和 PSI 公司合作开发了新版本的FKM多光谱荧光动态显微成像系统(Küpper,2007)。新型的FKM增加了如下几种主要功能:1.能够对荧光成像图中选定部位进行叶绿素荧光动力学分析,这样就能直接对比分析植物健康部位和受损部位的差别;2.具备多种不同光质(红光、蓝光、白光、绿光、UV紫外光、远红光等)的激发光源,可以研究各种不同天线色素的叶绿素荧光动力学和其他非叶绿素荧光动力学;3.配备光谱仪,可以直接研究激发的各种荧光的光谱变化。同时,Küpper将FKM和FluorCam结合使用,将FKM的应用从单纯的藻类扩展到对高等植物叶绿体的活体原位研究,尤其是重金属对植物微观光合结构的毒害效应。

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图8. 上图:FKM初期设计及其藻类叶绿素荧光成像图;下图:FKM最新设计及其镉胁迫处理天蓝遏蓝菜Thlaspi caerulescens显微结构叶绿素荧光成像图

正是由于FKM技术提供了这样强大的研究工具,之后很多科学家相继使用FKM技术研究了海州香薷Elsholtzia splendens、沼泽景天Crassula helmsii、Haumaniastrum katangense、天蓝遏蓝菜Thlaspi caerulescens等植物和束毛藻Trichodesmium、金鱼藻Ceratophyllum demersum、米氏凯伦藻Karenia mikimotoi等藻类的Fe、Cu、Ni、Zn、Cd微观毒害与调控机制,以及藻类的固氮作用与由于富营养化造成水华的发生机理(Higo, 2017;Andresen,2016; Peng,2013;Peng,2012;Leitenmaier,2011;Küpper,2009)。

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图9. 束毛藻Trichodesmium的荧光动态显微(FKM)成像图(Küpper,2008)

三、   多光谱/高光谱成像技术

植物由于在可见光-近红外波段具备独特的反射光谱特征曲线。因此通过特定波段反射率计算的各种植被指数就可以反应植物相应的生理特征。

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图10. 植物的反射光谱及不同波段的意义

常用的植被指数有归一化植被指数NDVI、光化学植被反射指数PRI、归一化叶绿素指数NPCI、简单比值指数SR、改进的叶绿素吸收反射指数MCARI、最优化土壤调整植被指数OSAVI、绿度指数G、转换类胡罗卜素指数TCARI、三角植被指数TVI等。而这其中最为常用的就是归一化植被指数NDVI,其计算公式为:

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这一指数反映了植物叶绿素在红光波段的高吸收和近红外波段的高反射,与植物的叶绿素浓度密切相关,进而可以反推出植物氮含量(Maarschalkerweerd,2015)。

FluorCam叶绿素荧光系统本身即具备NDVI成像测量功能,可以完成叶绿素荧光与NDVI成像的同步测量。

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图11. 使用FluorCam成像系统测量的珊瑚与藻类共生体的NDVI成像(Leal,2015

而为了满足现代植物表型组学研究的需要,PSI公司在FluorCam叶绿素荧光成像技术的基础上,整合了LED植物智能培养、自动化控制系统、植物热成像分析、植物近红外成像分析、植物高光谱分析、自动条码识别管理、RGB真彩3D成像、自动称重与浇灌系统等多项先进技术建立了PlantScreen植物表型成像系统以最优化的方式实现大量植物样品——从拟南芥、玉米到各种其它植物的全方位生理生态与形态结构成像分析,是目前植物表型组学包括养分元素与重金属胁迫研究最全面的仪器系统。

 

图12. PlantScreen植物表型成像分析系统及其各个功能模块

如果需要在更大尺度上进行多光谱/高光谱成像分析,目前最为适合的就是无人机遥感技术。无人机遥感技术是无人机技术与遥感成像分析技术等高新技术的创新性集成系统平台,使植物表型分析真正从实验室走向大田野外、从单个叶片或单株植物或几十平方米的视野一下子跃升到几百亩或者上千亩甚至更大范围、从每天几千株植物的高通量跃升到几百万几千万甚至更多的超高通量测量分析。

International Maize and Wheat Improvement Center利用无人机表型分析技术,对大田玉米贫氮胁迫抗性进行了研究分析,研究结果参见下列图表:

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图13. 不同梯度氮胁迫(左图中ss指高度氮胁迫、ms为中度氮胁迫、c为正常施肥)及根据NDVI得出的氮胁迫指数

UAS-4四旋翼专业表型分析无人机平台或UAS-8八旋翼专业表型分析无人机平台配置高清晰RGB镜头、多光谱镜头、高光谱镜头、红外热成像镜头及LiDAR等传感器,及相应数据处理分析软件组成。多年与PSI植物表型分析研究中心合作,积多年植物/作物表型分析技术服务经验,为植物表型分析提供全面技术方案;PhenoUAS可测量分析植物的形态结构性状如叶面积、覆盖度、株高、冠幅等等,还可测量分析植物的功能性状如长势、抗性、胁迫(包括生物胁迫与非生物胁迫)、产量评估等。

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图14. 左:PhenoUAS-8八旋翼无人机植物表型分析平台在陕西杨凌飞行作业示范;右上:西北农林科技大学小麦田NDVI遥测成像图;右下:陕西佛坪大熊猫保护区植被分类遥测图,粉色-松树,绿色-竹子,黄色-裸地道路,蓝色-雪

四、   激光诱导击穿光谱分析技术Laser-Induced Breakdown Spectroscopy(LIBS)

叶绿素荧光成像技术、多光谱/高光谱成像分析技术虽然可以最优化地测量植物对元素和重金属的生理生态反应,但毕竟不能直接测量元素和重金属在植物体的具体含量和分布情况。

但是,传统的植物元素测量方法比如比色法colorimetry、光谱测定法spectrometry、高温碱溶high temperature alkaline dissolution和电热气化electro-thermal vaporization 配合上电感耦合等离子体原子发射光谱inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy (ICP-AES)、离子淌度谱法ion mobility spectrometry (IMS) 和石墨炉原子吸收光谱法graphite furnace atomic absorption spectrometry (GFAAS)等。

这些技术用于植物元素分析还是有很多问题。比如样品需要消解、样品的预处理需要消耗昂贵的化学药品并耗费大量时间、由此还会导致环境的潜在破坏(Tripathi,2015)。而这些技术更大的局限性是难以表现植物元素的差异性分布,同时又因为必须对样品进行破坏性预处理而不能做到无损/准无损原位测量和长期监测。

激光诱导击穿光谱分析技术Laser-Induced Breakdown Spectroscopy(LIBS)的逐渐成熟解决了这一问题。该技术通过超短脉冲激光聚焦样品表面形成等离子体,利用光谱仪对等离子体发射光谱进行分析,以此来识别样品中的元素组成成分。该技术的特点有:

l  快速直接分析,几乎不需要样品制备

l  可进行准无损测量

l  可进行元素分布二维制图

l  可进行远距离遥测

l  可检测几乎所有元素

l  可同时分析多种元素

l  基体形态多样性 - 可以检测几乎所有固态样品,乃至液体、气体样品

l  精度最高可达到ppm级

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图15. 左:Sci-Trace LIBS元素分析系统;右:X-Trace LIBS元素遥测分析系统

image.png这一技术最初主要用于材料、冶金、地质、矿物等研究。CEITEC欧洲工程技术中心的AtomTrace LIBS研究团队可以说是最早关注到LIBS技术在生命科学和生物医学领域应用的科研团队之一。2005年,Jozef Kaiser博士(Atomtrace科学主任、布尔诺大学教授、激光光谱学研究室负责人、CEITEC物质特性与表面科学研究部主任)等在European Physical Journal上发表了“Mapping of the metal intake in plants by large-field X-ray microradiography and preliminary feasibility studies in microtomography”(Eur.Phys.J. D 32, 113-118);2006年又利用LIBS飞秒激光光谱分析技术研究分析了植物样品铁、锰元素的分布并首次作出完整叶片铁元素的二维分布图,并发表了“Femtosecond laser spectrochemical analysis of plant samples”(Laser Phys.Lett.3, No.1, 21-25, 2006)。

2007年至2010年,以Kaiser博士为代表的研究团队利用μCT与飞秒激光诱导击穿光谱技术(LIBS)及LA-LCP-MS等技术,对向日葵等植物组织中重金属元素吸收积累进行了研究分析,先后发表论文:

1)  Monitoring of the heavy-metal hyperaccumulation in vegetal tissues by X-ray radiography and by Femto-second laser induced breakdown spectroscopy. Microscopy research and technique 70:147-153, 2007

2)  Utilization of laser induced breakdown spectroscopy for investigation of the metal accumulation in vegetal tissues. SpectrochimicaActa Part B 62:1597-1605

3)  Investigation of heavy-metal accumulation in selected plant samples using laser induced breakdown spectroscopy and laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry. Appl. Phys. A 93:917-922, 2008

4)  Multi-instrumental analysis of tissues of Sunflower plants treated with Silver(I) ions—plants as bioindicators of environmental pollution

5)  Mapping of lead, magnesium and copper accumulation in plant tissues by laser-induced breakdown spectroscopy and laser-ablation inductively coupled plasma mass spectrometry. SpectrochimicaActa Part B 64:67-73, 2009;

6)  Sunflower plants as bioindicators of environmental pollution with lead(II) ions. Sensors 9:5040-5058, 2009

7)  Detection of lead in Zea mays by dual-energy X-ray Microtomography at the SYRMEP Beamline of the ELETTRA Synchrotron and by Atomic Absorption Spectroscopy. Microscopy Research and Technique 73:638-649, 2010;

8)  Determination of plant thiols by liquid Chromatography Coupled with Coulometric and Amperometric Detection in Lettuce treated by lead(II) ions. Electroanalysis 22 No.11:1248-1259, 2010

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图17. 重金属污染下玉米、向日葵及生菜LIBS元素分析叶片铅、镁浓度二维分布图

在这些研究中,CEITEC/Atomtrace LIBS研究团队不仅最早利用LIBS技术作出完整叶片元素分布图,还最早利用LIBS技术与显微CT(μCT)相结合进行三维化学成像构建,同时还开展了小鼠肾脏、蛇骨、古生物牙齿等动物样品的LIBS元素分析研究。

2012年,Kaiser博士等根据多年的研究成果和同行研究情况,撰写发表了综述性文章“Trace elemental analysis by Laser-induced breakdown spectroscopy---biological applications”(Surface Science Report 67:233-243, 2012)。上述研究成果奠定了以Kaiser博士等为代表的激光光谱学实验室LIBS技术在全球生命与环境科学应用领域的领先地位。

在研究植物养分利用与重金属毒害时,LIBS技术经常会与叶绿素荧光技术联合应用。2012年,CEITEC激光光谱学实验室研究团队与PSI公司合作,在《SpectrochimicaActa Part B》发表了“Application of laser-induced breakdown spectroscopy to the analysis of algal biomass for induxrial biotechnology”,该研究利用LIBS技术和特制液体样品激光作用室,分析了藻类培养液与生物膜中钾、镁、钙、钠等与藻类至关重要的元素及铜等毒性重金属元素积累。

印度阿拉哈巴德大学则通过FP100叶绿素荧光仪(FluorCam的非成像版)和LIBS技术结合,研究了小麦经过重金属处理,植物体内元素含量变化与叶绿素荧光光合特性的关系。研究成果连续发表了多篇文献(Tripathi,2016;Tripathi,2015)

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图18. 左:LIBS藻类测量方案;右:藻类生物膜脉冲激光剥蚀孔

 

关于本文涉及到的仪器技术详细信息请访问北京易科泰生态技术有限公司官网,或者与我们联系获取技术快讯与文献原文。

易科泰生态技术致力于引进、消化、吸收和创新国际先进生物生态科研技术,提供植物表型分析、作物胁迫敏感性与抗性检测、光养生物反应器/藻类培养与在线监测、生态毒理学检测技术方案和实验服务与合作。旗下的Ecolab实验室目前配备有FluorCam封闭式荧光成像系统、FluorCam封闭式荧光成像系统、FluorCam便携式荧光成像仪、FL3500叶绿素荧光仪、FluorPen手持式叶绿素荧光仪、AquaPen藻类荧光仪、PolyPen手持式植物光谱测量仪、SpectraPen LM500手持式光谱仪、PlantPen手持式光谱仪、FMT150藻类培养与在线监测系统、MC1000 8通道藻类培养与在线监测系统、MicroMac1000全自动营养盐分析监测系统、FMS CO2/O2呼吸测量分析系统等,并与中科院植物所、中科院水生所、中国农科院、陕西师范大学等建立了长期技术合作交流关系。欢迎联系开展实验合作与技术培训。邮箱:eco-lab@eco-tech.com.cninfo@eco-lab.cn; 电话:010-62615899

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